【知识贴】9个问题带你重新认识荧光定量PCR仪,附仪器推荐!
发布时间: 2022-09-09 09:47:48

说到荧光定量PCR仪,面对一堆名词,一头雾水。扩增曲线、标准曲线、域值、CT值、熔解曲 线、基线到底都是什么意思?PCR荧光图不认识?今天带大家一起学习一下。


PCR所涉及的名词解释



扩增曲线:

扩增曲线是指PCR过程中,以循环数为横坐标,以反应过程中实时荧光强度为纵坐标所做的曲线。


基线(Baseline):

基线是指在PCR扩增反应的最初数个循环里,荧光信号变化不大。接近一条直线,这样的直线即是基线。


荧光域值(threshold)的设定:

一般将 PCR反应前 15个循环的荧光信号作为荧光本底信号,荧光域值是PCR3—15个循环荧光信号标准差的10倍,荧光域值设定在 PCR扩增的指数期。一般来说,每台仪器在使用前都已经设置好了荧光阈值。


CT值:

CT值表示每个PCR反应管内荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。研究表明,各模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多,CT值越小,反之亦然。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标难曲线,其中横坐标代表起始拷贝数的对数。纵坐标代表CT值。因此,只要获得未知样品的CT值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。


判断扩增曲线是否良好的指标主要有几个方面:


A:曲线拐点清楚,特别是低浓度样本指数期明显,扩增曲线整体平行性好,基线平而无上扬现象,低浓度样本扩增曲线指数期明显。

B:曲线指数期斜率与扩增效率成正比,斜率越大扩增效率越高。

C:标准的基线平直或略微下降,无明显的上扬趋势。

D:各管的扩增曲线平行性好,表明各反应管的扩增效率相近。


熔解曲线:

对PCR产物加热,随着温度的升高,双链扩增产物逐渐解链,导致荧光强度下降,到达某一温度时(Tm),会导致大量的产物解链,荧光急剧下降。利用该特点以及不同PCR产物其Tm值的不同,因此使其荧光信号发生迅速下降的温度也不同,可通过此对PCR的特异性进行鉴定。


熔解曲线(取对数曲线):

对熔解曲线取对数,形成峰图,更直观的显示产物片段的情况。由于熔解温度即是该DNA片段的Tm值,以此可以判断影响DNA片段Tm值的一些参数,比如片段大小、GC含量等等。一般来说,根据我们的引物设计原则,扩增产物长度在80-300bp范围,那么熔解温度应该是在80℃-90℃之间。


A:如果在80℃-90℃之间出现唯一主峰,说明荧光定量PCR完美;

B:如果在80℃-90℃之间出现主峰,80℃以下出现杂峰,基本考虑引物二聚体,可尝试提高退火温度解决;

C:如果在80℃-90℃之间出现主峰,温度上升又出现杂峰,基本上考虑有DNA污染,需要在实验初始阶段去除DNA。


标准曲线:

将标准品稀释至不同浓度,作为模板进行PCR反应。以标准品拷贝数的对数值为横坐标,以测得的CT值作为纵坐标,绘制标准曲线。对未知样品进行定量时,根据未知样本的CT值,即可在标准曲线中得到样品的拷贝数。标准曲线在绝对定量的时候非常重要。


PCR仪常见问题解答



Q:RT-PCR、QPCR、Real-time PCR、real-time RT-PCR有什么区别?

A:RT-PCR就是逆转录 PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR),是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中,一条RNA链被逆转录成为互补DNA,再以此为模板通过PCR进行 DNA扩增。

Real-time-PCR和 qPCR(Quantitative Rea-ltime-PCR )是一码事,都是实时定量PCR,指的是PCR过程中每个循环都有数据的实时记录,因此可以对起始模板数量进行精确的分析。

虽然Real-time PCR(实时荧光定量PCR)和 Reverse transcription PCR(反转录PCR)看起来都可以缩写为RT-PCR,但是,国际上的约定俗成的是:RT-PCR特指反转录PCR,而Real-time PCR一般缩写为 qPCR(quantitative real-time PCR)。

而real-time RT-PCR(RT-qPCR), 就是结合了荧光定量技术的反转录PCR:先从 RNA 反转录得到 cDNA(RT),然后再用 Real-time PCR进行定量分析(qPCR)。


Q:为什么荧光定量PCR的扩增产物片段长度应该控制在80-300bp范围内?

A:每个基因序列长短不一,有的好几kb,有的几百bp,但是我们在设计引物的时候只需要要求产物长度80-300bp,太短或者太长都不适合做荧光定量PCR检测。

产物片段太短,无法跟引物二聚体区分,引物二聚体的长度大概在30-40bp,小于80bp很难区分是引物二聚体还是产物。产物片段太长,超过300bp,容易致使扩增效率低下,不能有效的检测出该基因的量。

打个比方,你在数一间教室里面有多少个人 的时候,只需要数一下有几张嘴就可以了,在检测基因的时候也是一样的,只需要检测某个基因的某一段序列来代表整个序列即可。如果你为了想数多少个人,既要数多少张嘴也要数多少个鼻子、耳朵、眼镜,反而容易数错。


Q:引物设计最佳长度是多少?

A:一般来说,引物长度大概在20-24bp范围是比较好的。当然我们在设计引物的时候一定要注意引物的TM值,因为这个关系到最佳退火温度。经过大量的实验证明,60℃是一个比较好的TM值。退火温度太低容易导致非特异性扩增,退火温度太高一般会导致扩增效率比较低,扩增曲线起峰比较晚,CT值延后。


Q:采集样本量的多少会不会影响实验结果?

A:不会。很明显,采集样本量多,提取的RNA就比较多,cDNA就比较多, 目的片段就比较多。对于绝对定量,要计算出某个目的片段的拷贝数,那么采集样本量的多少肯定会影响实验结果。比如检测血液里面的乙肝病毒HBV,就是检测出一定量(1ml)血液里面的HBV含量。

对于科研工作中常用的相对定量,样本量的多少与实验结果无关,因为相对定量是指目的基因和内参基因相比较,你可以认为它们是存在于同一核酸链条的上下游片段,如果样本量多了,内参基因和目的基因都同时等比例增加,不影响结果。


Q:反转录酶效率高低会不会影响实验结果?

A:同上。此处必须注意,我们希望获得较高的反转录效率,更希望反转录酶的反转录效率比较稳定,得到均一性的结果。这就要考验各大公司对于反转录试剂盒的优化能力了。


Q:Taq酶的效率会不会影响实验结果?

A:Taq酶的效率影响比较大,一般要求用热启动Taq酶,且效率要比较高才行,商品化的荧光定量试剂盒,每个厂家都会在自己的产品的基础上,把效率优化到最好的状态,接近于100%,效率太低实验结果不可用。对于不同公司的产品,这是衡量优劣的指标。


Q:荧光染料的多少会不会影响实验结果?

A:当然是有影响的。荧光染料过于饱和,会导致某些仪器出现噪点干扰;荧光染料不饱和,荧光值太低,导致提前进入平台期,扩增曲线平缓。在荧光定量实验中主要看CT值,因此后期扩增曲线进入平台期显得不那么重要,只是图形不够美观罢了,如果二者必选其一的话,宁愿选择荧光染料略微不饱和。在使用同一公司的同一款产品时,该影响基本可以忽略。


Q:PCR管的透光度会不会影响实验结果?

A:当然是有影响的。但是对于同一厂家同一批耗材,这种影响可以忽略。推荐大家用96孔板加高透膜,使耗材的透光度影响降到最低。


Q:操作过程中的误差会不会影响?

A:操作过程的影响,主要体现在均一性上。均一性是指体系内的所有组分均匀的混合在一起,瞬时离心可以解决均一性问题。另外,对于生手来说,最好调整PCR体系在20ul以上,过小的体系更容易产生误差。再请看下图:如果退火温度优化得合适,引物浓度对CT的影响会降到最低。你会明白,有的操作误差(比如引物浓度)是可以通过优化退火温度来避免的。


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